細胞焦亡作為機體重要的天然免疫反應，在拮抗和清除病原菌感染中發揮關鍵作用。當革蘭氏陰性菌侵入宿主細胞后，其外膜的重要病原分子模式LPS（脂多糖，也稱內毒素）會被宿主細胞內的天然免疫受體caspase-4/5/11識別，LPS激活的caspase-4/5/11會進一步切割活化焦亡蛋白GSDMD釋放其膜打孔活性，導致細胞焦亡，激發宿主的抗菌炎癥反應。同時，細菌也采用了多種策略來逃避宿主的免疫防御，例如通過獨特的III型分泌系統向宿主細胞"注入"專門的效應蛋白，干擾宿主的免疫防御通路。2021年，北京生命科學研究所邵峰團隊發現痢疾桿菌（Shigella）分泌的效應蛋白OspC3可以特異識別宿主細胞內的天然免疫受體caspase-4/11，通過催化caspase酶活中心的關鍵精氨酸發生一種全新的ADP-riboxanation翻譯后修飾使caspase-4/11失活，阻斷其活化下游GSDMD介導的細胞焦亡免疫防御。然而效應蛋白OspC3是如何特異地識別宿主靶標caspase-4/11，又是如何催化新穎的ADP-riboxanation修飾拮抗細胞焦亡的精確分子機理等關鍵科學問題有待進一步回答。
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2023年1月9日，中科院生物物理研究所王大成/丁璟珒課題組和北生所邵峰團隊合作，在《Nature Structural & Molecular Biology》發表題為"Structural mechanisms of calmodulin activation of Shigella effector OspC3 to ADP-riboxanate caspase-4/11 and block pyroptosis"的研究論文。該研究揭示了效應蛋白OspC3利用宿主細胞的鈣調蛋白（calmodulin，CaM）作為輔助因子激活其酶學活性，特異地識別宿主靶標caspase-4/11并催化全新的精氨酸ADP-riboxanation修飾，阻斷宿主細胞caspase-4/11-GSDMD焦亡通路的完整分子機理。
研究人員首先發現OspC3可以有效地對靜息狀態未發生自剪切的caspase-4/11和細菌LPS激活后發生了自剪切的caspase-4/11兩種形式進行修飾，但是激活形式的caspase-4/11活性中心如果被模擬底物切割位點四肽序列的共價抑制劑zVAD不可逆地占據，會極大地削弱OspC3對caspase-4/11的修飾，這表明底物非結合狀態的caspase-4/11，不論激活與否都是OspC3的底物。研究人員隨后發現，ADP-核糖基特異性結合蛋白Af1521可與修飾后的caspase-4/11產物形成穩定的1:1復合物，通過解析Af1521與caspase-4被修飾后產物的復合物的高分率晶體結構，研究人員首次清晰地觀察到ADP-riboxanation修飾的精確化學結構，caspase-4修飾位點R314的側鏈胍基脫去一個末端Nω原子后與來自NAD+的ADP-核糖基核糖環上的C1原子和C2位羥基分別連接，形成了一個全新的五元惡唑烷環，該結果為精氨酸ADP-riboxanation這種全新的翻譯后修飾提供了直接的結構證明。
OspC3及其所屬的細菌效應蛋白家族具有典型的雙結構域特征，其N端結構域和任何已知的蛋白質沒有序列同源性，而C端包含一個保守的ankyrin-repeat結構域（ARD），這類結構域通常介導蛋白質相互作用，因此推測該結構域是OspC3的底物識別結構域。研究人員進一步通過解析OspC3 ARD結構域與caspase-4底物復合物的晶體結構，確定了OspC3 ARD結構域通過一系列氫鍵網絡和疏水作用特異地招募宿主靶標caspase-4/11。
在體外重組OspC3修飾caspase-4/11的酶活實驗中，研究人員發現OspC3需要幾乎與底物蛋白caspase-4/11相當的量才能實現對底物的完全修飾，這有悖于酶催化底物反應高效性的經典認識。通過免疫共沉淀結合質譜的方法，研究人員鑒定出宿主的鈣調蛋白CaM以Ca2+-free的形式與OspC3形成穩定的二元復合物，極大地提高了OspC3的催化效率。隨后，研究人員成功地解析了OspC3與CaM二元復合物的高分辨率晶體結構，發現Ca2+未結合狀態的CaM通過兩個亞結構域分別以廣泛的疏水作用牢牢抓住OspC3的N端結構域，而OspC3的N端結構域呈現出經典Rossmann折疊構象，與已知的ADP-核糖基轉移酶結構域具有相似的結構特征和保守的NAD+結合基序。為了進一步闡明OspC3利用NAD+作為供體催化caspase-4/11的精氨酸發生ADP-riboxanation修飾的完整酶學機理，研究人員又成功解析了OspC3-CaM-caspase-4三元復合物及其與2-F-NAD+（非水解型NAD+類似物）的四元復合物晶體結構，發現OspC3的N端的酶活中心通過酸性氨基酸D231固定caspase-4活性中心R314側鏈胍基的末端Nω原子，使ADP-核糖基C1位靠近R314胍基的Nδ原子，從而利于NAD+煙酰胺基團的離去和在修飾位點R314 Nδ原子上發生第一步經典的ADP-核糖基修飾；而酶活中心的另一個酸性氨基酸D177則負責激活ADP-核糖基C2位的羥基親核進攻R314側鏈胍基C原子發生脫氨反應，使精氨酸側鏈胍基和ADP-核糖基團形成一個惡唑烷環。隨后，研究人員將結構研究的發現利用定點突變的方法在生化、細胞和Shigella感染小鼠三個層面進行了驗證，完整地闡明了OspC3利用宿主輔因子CaM特異的對caspase-4/11進行精氨酸ADP-riboxanation修飾的分子機理。
這項研究工作通過一系列三維結構分析與功能實驗驗證，揭示了痢疾桿菌效應蛋白OspC3特異地識別宿主天然免疫受體caspase-4/11，并利用宿主鈣調蛋白CaM作為輔因子催化全新的精氨酸ADP-riboxanation修飾，阻斷宿主細胞caspase-4/11-GSDMD焦亡防御通路的完整分子機理，也為ADP-riboxanation這種全新的翻譯后修飾的酶學反應機理提供了全面深入的理解，為進一步尋找和開發新型抗菌藥物或細菌減毒疫苗提供了新策略。
圖 痢疾桿菌效應蛋白OspC3拮抗宿主細胞焦亡通路的分子機理
A. 痢疾桿菌效應蛋白OspC3阻斷caspase-4/11焦亡通路拮抗宿主天然免疫的模式圖；B. OspC3-CaM-caspase-4-2-F-NAD+四元復合物結構及催化關鍵殘基展示；C. 精氨酸ADP-riboxanation修飾后的caspase-4結構；D. OpsC3催化關鍵位點突變體在痢疾桿菌侵染細胞實驗中進行驗證。
中科院生物物理研究所丁璟珒研究員和北生所邵峰教授為本文的共同通訊作者，丁璟珒課題組侯彥婕博士和邵峰課題組生物物理所籍博士研究生曾歡為本論文的共同第一作者。該研究得到中科院戰略先導科技專項、科技部重點研發計劃、基金委優青項目及中科院青促會項目的支持。
文章鏈接：https://www.nature.com/articles/s41594-022-00888-3
（供稿：丁璟珒研究組）
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